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Lassen die Zellen hellgrünes Licht - in situ GFP Transfektion

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Lassen die Zellen hellgrünes Licht - in situ GFP Transfektion

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Ich suchte instructable Website. Es gibt keine aufschlussreiche Rede über die Transfektion, so dass ich beschlossen, eine zu diesem Thema zu erstellen. In diesem anweisbaren, werde ich Ihnen zeigen, wie Green Fluorescent Protein (GFP) in polarisierte MDCK-G-Zellen zu liefern, um die Zellen zeigen hellgrüne Fluoreszenz unter ultraviolettem Licht mit einem Elektroporation System namens iPorator.

GFP:
Das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) ist ein Protein, das eine hellgrüne Fluoreszenz zeigt, wenn es dem blauen bis ultravioletten Licht ausgesetzt wird. GFP wurde zuerst von der Qualle Aequorea Victoria vom japanischen Wissenschaftler Osamu Shimomura (er gewann den Nobelpreis in der Chemie im Jahr 2008 für die Entdeckung und Entwicklung von GFP) im Jahr 1961 isoliert. GFP war weit verbreitet in der Kennzeichnung der Organismen für die Identifizierung verwendet. Wenn das GFP innerhalb der Zelle abgegeben wird, fluoresziert die Zelle unter Fluoreszenzmikroskopie. In diesem instructable werde ich gWiz GFP verwenden.

Transfektion:
Transfektion ist der Prozess der Umsetzung von Nukleinsäuren in Zellen zu blockieren oder einige Funktionen der Zelle. Transfektion kann in chemische Transfektion (Lipofectamin 2000 von Life Technologies ist die häufigste), nicht-chemische Transfektion (Elektroporation ist der häufigste Weg), und Partikel-basierte Transfektion wie Magnetofektion unterteilt werden. Es ist sehr schwierig, vollständig polarisierte oder vollständig differenzierte Zellen mittels chemisch-basierter Verfahren zu transfizieren. Die chemische Trasnfektion und die partikelbasierte Transfektion führen neben den gewünschten Nukleinsäuren in die Zellen während der Transfektion zusätzliche Stoffe (wie Lipide, Polymere und magnetische Nanopartikel) ein, die nach der Transfektion unerwünschte oder unerwartete Ergebnisse erzeugen können. Bei der Elektroporation wird die Zellmembran viele kleine Löcher unter der Elektrodenkraft öffnen und Nucleinsäuren können durch diese Löcher in die Zelle gelangen. Traditionelle Elektroporation wendet eine sehr hohe Spannung (Hunderte bis Tausend Volt) in Zellsuspension an. Es tötet viele Zellen, und für adhärente Zellen unterscheiden sich ihre Eigenschaften in der Zellsuspension und in der Zellschicht. Für adhärente Zellen liefert die in situ Transfektion das beste Ergebnis, da sich die Zellen im physiologisch relevanten postmeitotischen Zustand befinden. In diesem instructable werde ich vollständig differenzierte MDCK-G (Madin-Darby Canine Kidney Cells) Zellen in situ mit dem Elektroporationssystem iPorator von primax biosciences transfizieren. Diese Maschine verwendet einen kleinen Strom statt einer hohen Spannung während der Transfektion, um die Zellschäden zu reduzieren. Während der Transfektion wachsen Zellen auf dem porösen Membraneinsatz (keine Re-Suspension erforderlich). Dieses System ist am besten für adhärente Zellen. Dieses System funktioniert jedoch nicht für Suspensionszellen.

Schritt 1: Vorgehensweise:

Lassen die Zellen hellgrünes Licht - in situ GFP Transfektion

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Verfahren:
1. Samen der Zellen:
Ernten Sie die MDCK-G-Zellen aus dem Kolben. Hier überspringe ich das Ernteverfahren, weil es ein ziemlich normales Verfahren in jedem Biologielabor ist. Samen der Zelle in Millicell 24-Well-Zellkultur-Inserts (Millipore PIRP12L04). Für die MDCK-G-Zelle setzte ich 75K Zellen / 200 & mgr; l in jeden Einsatz und 900 & mgr; l Kulturmedium in jede untere Zuführungsquelle. Dieser Einsatz hat 1um PET poröse Membran (dh es gibt viele kleine Löcher auf der Membran). Zellen können von beiden Seiten ernähren.
Transfektion:
24 Stunden nach der Aussaat bedeckt die MDCK-G-Zellen die gesamte Membran und bildet eine Mono-Schicht.
Verdünnen Sie das gWiz-GFP mit OPTI-MEM (Gibco 31985-070). Die GFP-Konzentration, die ich verwende, ist 20 & mgr; g / mL. Entfernen Sie das Kulturmedium aus dem Einsatz und fügen Sie 150 μl verdünntes GFP in den Einsatz. Der iPorator kann vier 24-Wannen-Inserts (oder zwei 6-Loch-Insrten) gleichzeitig transfizieren. So bereite ich vier Einsätze mit GFP.
IPorator erfordert spezielle Elektroden während der Transfektion (Primax Bioscience, E24A1108). Füllen Sie die untere Elektrodenkammer mit 1 ml Opti-MEM. Übertragen Sie die Einsätze mit GFP in die untere Elektrodenkammer und setzen Sie sie in die obere Elektrode.
Als nächstes setzen Sie den Elektrodensatz mit Einsätzen in den iPorator.
Klicken Sie auf "Transfektion" in der Benutzeroberfläche.
Das Programm hat ein eingebautes MDCK-G DNA-Transfektionsprotokoll, also wähle ich einfach dieses Protokoll aus und klicke auf "Start". Es dauert etwa 4 Minuten, um die Transfektion zu beenden.
Nach der Transfektion die Elektrode aus der Maschine herausnehmen und die Einsätze wieder auf die ursprüngliche Zuführungsplatte übertragen. Die Inserts bei Raumtemperatur für etwa 10 Minuten mit GFP belassen und dann das GFP mit 200 & mgr; l frischem Kulturmedium ersetzen. Setzen Sie die Inserts zurück zu Zellkultur Inkubator für 24 Stunden, um die GFP auszudrücken. Für die gWiz-GFP, können Sie sehen, einige Expression 2 Stunden nach der Transfektion, aber Sie müssen mindestens über Nacht warten, um es vollständig auszudrücken.

Schritt 2: Ergebnis prüfen

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3. Prüfen Sie das Ergebnis:
24 Stunden nach der Transfektion die Einsätze aus dem Inkubator nehmen und unter der Fluoreszenzmikroskopie überprüfen. Sie sehen eine schöne Zellschicht wird mit GFP transfiziert und zeigt hellgrüne Fluoreszenz. Die Fluoreszenz kann länger als eine Woche unter richtiger Kultivierung dauern.

Schritt 3: Weitere Bilder und Tipps zum Fotografieren:

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Hier sind noch mehr Bilder.
Fluoreszenzabbildungen:
1. Versuchen Sie, die ganze Nacht zu blockieren.
2. Erhöhen Sie die Belichtungszeit.
3. Geben Sie den Einsatz oben auf eine Glasplatte erhöht die Schärfe der Zellen.
4.focus die Zellenschicht unter Verwendung der kürzeren Belichtungszeiteinstellung. Die Reaktionszeit der Kamera wird unter langer Belichtungszeit sehr lang sein.

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